AMH结构及免疫活性原料介绍

AMH结构及免疫活性原料介绍

* 来源 : * 作者 : admin1 * 发表时间 : 2018-05-09 * 浏览 : 588

抗缪勒氏管激素(AMH),也被称为缪勒氏管抑制因子(MIF,缪勒氏管抑制激素(MIH),缪勒氏管抑制物质(MIS),   是 140kDa,二聚体糖蛋白激素,是TGF-β超家族的一员。

一、背景

所有该家族的成员都是二聚体糖蛋白,在组织生长和细胞分化中起不同的调节作用。跟家族的其他成员一样,AMH蛋白的合成首先是作为一个大的前体,包含18个信号氨基酸序列,再加工成前激素原,最终生成同型二聚体。分泌前,成熟的激素经历糖基化和二聚体化,形成一个140kD的二聚体。二聚体由两个完全一样的70kD单体亚基,通过二硫键链接形成。每个单体由N端(即“pro”区)和C端(即“mature”区)组成。在细胞浆转运过程中,70kDAMH的单体会在“pro”区和“mature”区间的特定位点水解形成两段多肽:58kD的“pro”区和12kD的“mature”区。水解后,这两段多肽仍会以非共价形式结合。

二、基因及蛋白组成

编码AMH的基因位于19号染色的短臂上,AMH的氨基酸序列见下图

三、早期AMH的检测试剂

国外早期的AMH检测试剂(如DSL/IOT/Beckman Gen II等),对不同形式的AMH(如天然、重组(加工过或为加工))有不同的亲和力。这些试剂的抗体即可以结合单体AMH也可以结合二聚体AMH,无法对其有效辨别。DSL/IOT两种试剂,由于使用不同的抗体及不同的校准品,在测定同一样品时,会得出不同的检测结果;有研究表明,Gen II的测试结果会比DSL的低20-40%;但Gen II申报数据表明,Gen II的测试结果会比DSL的高出40%。这些数据表明,AMH在某些条件下存在形式并不稳定,且测试缺乏公认的检测标准。这在一定时间内限制了AMH在生殖评估、科研转化等方面的应用。

目前,国内的AMH检测主要以Beckman Gen IIELISA结果为参考依据,如Roche cobas AMH即将检测结果溯源至此。

四、AMH的结构

AMH由两个完全一样的70kD单体亚基,通过二硫键链接形成。每个单体由560个氨基酸排列而成。一般情况下,同型二聚体或其他低聚体的亚基是对称排列的。尽管有些例子表明,二聚体中的对称性是可以被破坏的。在这种情况下,一个单体上可被抗体识别的位点,在另一条单体上可能无法被识别。目前,没有理论或机理表明,AMH是一种对称性被破坏的二聚体。因此,识别一条单体上位点的抗体,也可以识别另一条单体上的位点。

通过还原剂处理,二聚体AMH二硫键打开,AMH会形成两条完全一致的单体。

451氨基酸处,即—RAQRSAGA—存在水解位点,通过蛋白酶处理,全长AMH将分为两段多肽,1-451氨基酸为“pro”区,452-560氨基酸为“mature”区。

水解后的AMH自发聚合,可形成非共价结合的水解-再结合形式的AMH

移除信号肽(1-18)和7个前肽,AMH会产生2个片段,一个有26-451氨基酸;另一个有452-560氨基酸。后者为AMHmature片段。26-451还可以继续处理为两个片段,一个为26-229,这里称为N-ter-pro区,另外的230-451这里称为midpro区。

 尽管目前对于AMH在临床相关样本中的形式尚不明确,但是已知在哺乳动物代谢循环中可存在不同形式的AMH蛋白,在多种组织和细胞中也可确认有不同形式的AMH蛋白。

五、AMH抗体配对选择举例

AMH存在不同的形态。针对不同区域位点的抗体配对,对不同形态的AMH检出有所不同。下图例举了针对不同位点的抗体

AB位于“pro”区,CD位于“mature”区(ABCD仅为所处区域的指示,不代表特定位点的抗体)。

AMH是对称性排列的二聚体,在夹心法ELISA中,同一抗体即可作为捕获抗体用,也可作为检测抗体用,如C-C(如无特殊说明,前者均作为捕获抗体,后者均作为检测抗体)这一配对可作为AMHmature-mature区检测。由于针对同一位点,该配对的检测不受样本水解与否的影响。类似的,A-A可作为AMHpro-pro区检测。C-D可作为AMHmature-mature区检测。A-C可作为AMHpro-mature区检测。D-B可作为AMHmature-pro区检测。

把每一组配对都用于试剂来测量同一样本中AMH含量。结果如下表所示


C-C

A-A

C-D

A-C

D-B

Sample

6.553

0.369

12.012

23.525

>19

Calibrators(OD  value)

Blank

0.086

0.069

0.093

--

0.062

0.1ng/ml   AMH

0.106

0.076

0.133

--

0.08

10ng/ml   AMH

1.26

1.178

2.94

--

1.5

不同配对的试剂被认为测量样本中不同的形态的AMHC-C测量的是全长二聚体和mature区二聚体的AMHC-D mature-mature区检测,测量的是全长二聚体和单体,mature区单体和二聚体AMH。因为这一配对可检测更多形态的AMH,所以测定的值要高于C-C的检测。A-Cpro-mature区检测,测量全长二聚体和单体,不能被C-D识别的全长和单体的AMH片段。因此,存在有的亚型可以被pro-mature检出,但是不能被mature-mature识别。

           六、同仁心主要抗体的位点信息


七、同仁心抗体的试剂符合率

1发光评测数据

C9F2包被/F10G7标记

发光物质:吖啶酯

靶标血清:罗氏COBAS  (N=82)


2
层析评测数据

15A3包被/C9F2标记

发光物质:铕

靶标血清:罗氏COBAS  (N=116)