25羟基维生素D生物活性原料的开发

25羟基维生素D生物活性原料的开发

* 来源 : * 作者 : admin1 * 发表时间 : 2017-03-29 * 浏览 : 1276


项目背景

维生素D是脂溶性类固醇类衍生物,主要包括VD2(麦角钙化醇)及VD3(胆钙化醇)。在肝脏中,维生素D被羟基化为25羟基维生素D,多与维生素D结合蛋白(VDBP)结合,进入循环系统;25羟基维生素D是维生素D在血液中主要运输形式,浓度高且稳定,半衰期长,其浓度被认为是评价维生素D水平的最佳指标[1]

 

据估计,全世界大约有30%-50%的儿童和成年人的血清25羟基维生素D缺乏,在妊娠妇女中尤为明显[2,3]

原料难点

25羟基维生素D作为一个临床有广泛需求的项目,我们在发光、免疫荧光等平台原料的研发过程中,遇到很多的困难,主要集中在以下方面:

l  小分子抗体的开发;

l  25(OH)D特异性抗体的开发;

l  兼容25(OH)D2、25(OH)D3、3-epi-25(OH)D3抗体的开发;

l  25(OH)D2、25(OH)D3等特异性抗体的筛选;

l  抗体原料要有足够的定量范围,覆盖临床上“不足”与“过量”;

经过长期的研发工作,同仁心的研发团队目前已成功开发了两组配对,基本上解决了上述各问题。

 

同仁心25羟基维生素D原料概况

在化学发光、酶联免疫、荧光纸条等免疫平台,我们均推荐采用”竞争法”检测本项目,根据具体检测目标不同,我们推荐的原料组合如下:

检测目标

货号

克隆号

类别

亚型

推荐使用

25(OH)D

(含D2&D3

GD11

BSA-25VD

抗原

IgG1

包被

GD21

1C7

抗体

——

标记

25(OH)D   3

(只检测D3

GD12

BSA-25VD3

抗原

IgG1

包被

GD22

17E11

抗体

——

标记

组合1:抗体1C7可以同时识别25(OH)D2及25(OH)D3,配套抗原BSA-25(OH)D同时偶联了25(OH)D2及25(OH)D3,该组合模式可以用于检测样本中的总25(OH)D;

组合2:抗体17E11能特异性识别25(OH)D3,不存在和25(OH)D2的交叉反应性,配套抗原BSA-25(OH)D3仅偶联25(OH)D3,该组合可以用于特异性检测样本中的25(OH)D3



同仁心25羟基维生素D原料性能

Ø  VD2&VD3特异性竞争结果

数据可见,1C7对VD2和VD3都有明显的竞争效果;17E11仅对VD3有竞争效果。

Ø  灵敏度及检测范围

 



两种组合模式,原料都可以实现3-300ng/ml范围内的准确定量。(Roche试剂定量范围:3-70ng/ml; Abbott试剂定量范围:8-160ng/ml)

 

      Ø  交叉反应性

注:Roche/Abbott为试剂说明书数据

 

Ø  对照原料的比较

科研人员选取了市场上部分主要的VD抗体,连同同仁心的抗体,进行了初步的性能评价:

在标记浓度相同的情况下,对抗体进行梯度稀释,已考察抗体的活性:

 

 

可见,同仁心的抗体活性要明显高于对照抗体。

此外,在竞争效果相近的情况下,比较了各组抗体的使用量:

 

 

数据可见,竞争效果相当的情况下,同仁心抗体使用浓度更低。


应用中的主要注意事项

1.     体系中盐浓度建议≤50mm;

2.     体系中避免使用小牛、羊血清等动物来源,组分不明物质,避免外源25OHVD或动物其他蛋白干扰评价结果。




参考文献               

[1] Holick MF Chen TC. Am J Clin Nutr 87(suppl),1080S – 1086S, 2008.

[2] Tao M, J Maternal Fetal Neonatal Med., 2012 Mar;25(3):237-9

[3] 《中国人群维生素D营养状况》,吴光驰,中国妇幼卫生杂志,2010,1(1):51-54

[4] 《维生素D与成年人骨骼健康应用指南(2014年标准版)》,中国老年学学会骨质疏松委员会维生素D学科组专家委员会:中国骨质疏松杂志,2014